為了滿(mǎn)足考察自然界中細(xì)胞“原位功能”這一共性科學(xué)需求，“現(xiàn)場(chǎng)”、“實(shí)時(shí)”的單細(xì)胞分選與測(cè)序已成為生命科學(xué)裝備研制領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展趨勢(shì)。盡管第三代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了儀器微型化，但是與測(cè)序?qū)拥膯渭?xì)胞精準(zhǔn)分選裝備卻仍然相當(dāng)笨重和昂貴，難以支撐各種科學(xué)考察中針對(duì)微生物組功能的“現(xiàn)場(chǎng)分析”。最近，青島能源所單細(xì)胞研究中心馬波研究員帶領(lǐng)的微流控系統(tǒng)團(tuán)隊(duì)，通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)易高效的單細(xì)胞分選與測(cè)序?qū)友b置，實(shí)現(xiàn)了每個(gè)試管有且只有一個(gè)細(xì)胞（“One-Cell-One-Tube”），有望服務(wù)于“現(xiàn)場(chǎng)”、“實(shí)時(shí)”乃至“便攜式”的單細(xì)胞分選與測(cè)序。
細(xì)胞是地球上生命的功能單元和進(jìn)化單位，因此單細(xì)胞分選與測(cè)序技術(shù)能夠在最“深”的精度解析生命的功能機(jī)制與進(jìn)化歷程。在微生物世界中，各種生境下微生物細(xì)胞的“原位活性”深刻地塑造著地球生態(tài)系統(tǒng)，但這些活性在樣品轉(zhuǎn)移與運(yùn)輸過(guò)程中往往發(fā)生難以預(yù)測(cè)的變化，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下也通常難以準(zhǔn)確保存與嚴(yán)格復(fù)制，因此“現(xiàn)場(chǎng)”、“實(shí)時(shí)”的單細(xì)胞分選與測(cè)序已成為微生物組方法學(xué)領(lǐng)域的共性挑戰(zhàn)。
與人體和高等動(dòng)植物細(xì)胞相比，微生物細(xì)胞通常更小（0.1-10 微米），更加難于精準(zhǔn)操縱，因此分離獲取目標(biāo)單細(xì)胞、并且實(shí)現(xiàn)測(cè)序反應(yīng)要求的“One-Cell-One-Tube”是一個(gè)關(guān)鍵難點(diǎn)。目前的自動(dòng)單細(xì)胞分離方法大多依賴(lài)于昂貴且體積龐大的熒光流式細(xì)胞分選儀（FACS）；而現(xiàn)有的手動(dòng)單細(xì)胞分離和測(cè)序方案，在依賴(lài)于操作人員熟練程度的同時(shí)，同樣需要顯微單細(xì)胞移液平臺(tái)、激光光鑷等同樣難以隨身攜帶的大中型儀器。此外，單細(xì)胞分選及核酸制備過(guò)程極易受到環(huán)境中飄浮微生物及其DNA的污染，而且這種污染通常難以在測(cè)序數(shù)據(jù)處理環(huán)節(jié)完全去除。因此，盡管目前MinION等第三代測(cè)序儀已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了便攜化，微生物單細(xì)胞分選和測(cè)序仍然操作繁瑣、污染干擾嚴(yán)重、而且難以滿(mǎn)足“現(xiàn)場(chǎng)”、“實(shí)時(shí)”乃至“便攜式”的要求。
針對(duì)上述挑戰(zhàn)，單細(xì)胞中心張強(qiáng)和王婷婷等發(fā)明了一種名為“FOCOT（Facile One-Cell-One-Tube）”的方法，能夠精確、高速、低成本地分離、獲取與分裝單個(gè)微生物細(xì)胞，從而與單細(xì)胞測(cè)序直接對(duì)接。首先，通過(guò)微流控技術(shù)，將細(xì)胞分散包裹在數(shù)十微米直徑的油包水微液滴中。其次，基于液滴顯微光學(xué)成像識(shí)別技術(shù)，分選出單細(xì)胞包裹液滴。第三，將單細(xì)胞包裹液滴順序分布于系列試管中，從而快速實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞的分離，以及每個(gè)試管有且只有一個(gè)細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)與單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增與測(cè)序的直接對(duì)接。
FOCOT平臺(tái)主要有三個(gè)特色。第一，在簡(jiǎn)易方便方面，FOCOT平臺(tái)除自行設(shè)計(jì)的芯片之外，僅需要電磁閥、平板電腦和普通光學(xué)顯微鏡，不需外接任何高成本商品化儀器平臺(tái)，具有易獲取、易替換、低成本等優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，模塊化、小型化、操作簡(jiǎn)便的設(shè)計(jì)使得該裝置適合在自然環(huán)境實(shí)地采樣條件下的攜帶、裝配和使用，也幾乎不需要額外的人員培訓(xùn)和技術(shù)維護(hù)，因此尤其適用于面向各種極端自然環(huán)境的科學(xué)考察，也有利于在普通實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用。
第二，在分選高效方面，FOCOT平臺(tái)通過(guò)顯微鏡下對(duì)包裹有單個(gè)細(xì)胞的液滴的準(zhǔn)確識(shí)別和分選，能有效避免假陽(yáng)性；而且其20秒每個(gè)的分選速度，與顯微單細(xì)胞移液、激光光鑷等現(xiàn)有的商品化分選裝備相比具有明顯優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，單細(xì)胞獲取率高于90%，培養(yǎng)成功比例至少80%，證明該方法能有效避免芯片表面吸附所導(dǎo)致的輸運(yùn)過(guò)程中細(xì)胞流失，而且對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有或較小損傷。
第三，在污染控制方面，FOCOT平臺(tái)涉及部件少，體積小型化，相對(duì)封閉，故在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，能夠方便地實(shí)現(xiàn)超潔凈環(huán)境空間控制、芯片消毒等操作，嚴(yán)格控制環(huán)境DNA的污染。對(duì)分離獲取的單個(gè)酵母細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增與測(cè)序后結(jié)果顯示，99%的有效序列可以與參考基因組匹配，表明該方法能有效避免環(huán)境中微生物帶來(lái)的DNA污染，平均基因組覆蓋率達(dá)到43.3%，與在昂貴的超凈空間設(shè)施中采用FACS等大型儀器系統(tǒng)分離獲取單細(xì)胞所獲得的測(cè)序結(jié)果相當(dāng)。
目前，通過(guò)耦合FOCOT與中心前期開(kāi)發(fā)的單細(xì)胞拉曼成像、拉曼流式細(xì)胞分選等技術(shù)，單細(xì)胞中心正在構(gòu)建一個(gè)服務(wù)于岸基、船基乃至手基等不同需求的非標(biāo)記式單細(xì)胞分析裝備體系，以服務(wù)于能源、環(huán)境、健康、海洋、土壤等諸多微生物組應(yīng)用領(lǐng)域。
上述工作由單細(xì)胞中心馬波和徐健共同主持完成，獲得了國(guó)家基金委科學(xué)儀器基礎(chǔ)研究專(zhuān)項(xiàng)、面上項(xiàng)目和中科院生物高通量分析技術(shù)服務(wù)網(wǎng)絡(luò)（STS）等項(xiàng)目的支持。
附錄：
Qiang Zhang, Tingting Wang, Qian Zhou, Peng Zhang, Yanhai Gong, Honglei Gou, Jian Xu, and Bo Ma, Development of a facile droplet-based single-cell isolation platform for cultivation and genomic analysis in microorganisms. Sci Rep, 7:41192, DOI: 10.1038/srep41192
