近日，大連化物所微型分析儀器研究組（105組）關亞風研究員和耿旭輝副研究員團隊與大連理工大學物理學院王曉娜教授團隊合作，在低成本高靈敏度激光誘導熒光檢測器（LIF）研制及其在單細胞低豐度蛋白定量分析方面取得新進展。
定量檢測單細胞表面和內部的低豐度蛋白，是在分子水平上研究生命過程的重要支撐技術。但商品化高靈敏LIF儀器價格昂貴，推廣應用受限。該團隊在前期工作中，采用小型、廉價的激光二極管替代激光器為光源，用自主研制的硅基弱光探測器替代進口光電倍增管（PMT）探測熒光，研制出“緊湊式”共聚焦LIF，對熒光素檢測限達到3 10-12 M（50 m檢測池），且功耗和開機平衡時間優(yōu)于進口儀器（Talanta, 2018, 182, 279）。在此基礎上，該團隊選用具有高亮度、長斯托克位移的BV605熒光標記的抗體，進行免疫熒光標記，用毛細管電泳（CE）和LIF定量分析了單個白血病細胞中的active caspase3蛋白，檢測限達7個分子（91 pL檢測體積內）。研究發(fā)現(xiàn)，98個單細胞內的active caspase3蛋白分子數范圍在629至12171個/細胞，顯示出極大的差異性。這是國際上首次報道在單細胞層次上定量檢測active caspase3蛋白（Analytical Chemistry, 2019, 91, 11493）。
(a) 激光誘導熒光檢測器原理圖；(b)放大的球面二向色反光鏡原理圖
近期，該團隊創(chuàng)新性地提出在LIF中設計使用球面二向色反光鏡，將檢測池放置在球心而不是常規(guī)的反光鏡的焦點上，同時使用40倍長焦距物鏡、527-70 nm寬帶發(fā)射濾光片與450-30 nm激發(fā)濾光片組合，將信噪比提高25倍。用流動注射方法（50 m檢測池）評價，該LIF對熒光素鈉的檢測下限（3 方法）低至1.5 10-13 M或8.9個熒光素鈉分子（在98 pL檢測體積內），是文獻報道的用流動注射方法評價LIF儀器的最高靈敏度。將該LIF與CE聯(lián)用，分析檢測三種氨基酸，檢測限從亞pM至fM級，比使用常規(guī)內徑毛細管的檢測限低上百倍，顯示出該檢測器在超痕量生物、環(huán)境樣品分析及單細胞內低拷貝數分子檢測應用中的潛力。
研究成果發(fā)表在《分析化學》（Analytical Chemistry）上。以上工作得到了國家自然科學基金項目、中國科協(xié)青年人才托舉工程項目、大連化物所科研創(chuàng)新基金項目的資助。
