近日，中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物分離分析新材料與新技術(shù)研究組研究員葉明亮、研究員秦洪強團隊與中科院上海藥物所研究員黃蔚團隊合作，提出并構(gòu)建了O-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）糖肽的可逆酶促化學(xué)標記策略，并與親水作用色譜富集方法相結(jié)合，實現(xiàn)了O-GlcNAc糖基化的高靈敏度檢測，為生物樣品中蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的高覆蓋度檢測提供了一種簡便有效的手段。
O-GlcNAc修飾主要發(fā)生在絲氨酸或蘇氨酸（Ser/Thr）的殘基，是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM），參與調(diào)控細胞代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等生理過程。由于O-GlcNAc的低豐度、高度動態(tài)變化性，極大地增加了富集與分析的難度。目前，現(xiàn)有的抗體等非共價作用富集策略存在親和力低、富集效率低等問題；化學(xué)酶促標記法等富集策略雖然顯著提高了糖肽富集的特異性，但是該策略引入大質(zhì)量標簽，降低了糖肽的鑒定效率。
基于可逆酶促化學(xué)標記策略的O-GlcNAc糖肽富集與檢測
針對上述問題，合作團隊發(fā)展了一種可逆標記的無損富集檢測策略。在該策略中，科研人員首先利用糖苷內(nèi)切酶突變體Endo-M N175Q的轉(zhuǎn)糖酶連接活性，將N-糖鏈基團連接到O-GlcNAc糖單元，從而提高O-GlcNAc糖肽的親水性；接著，基于延長糖鏈的親水性，采用親水作用色譜方法對O-GlcNAc標記糖肽進行富集；最后，利用野生型糖苷內(nèi)切酶Endo-M/S的水解活性，將富集后糖肽中的標記糖鏈釋放，實現(xiàn)O-GlcNAc糖肽的無痕富集，避免了標記糖鏈對O-GlcNAc糖肽鑒定效率的影響，以此實現(xiàn)了O-GlcNAc糖肽的無損富集與檢測。
合作團隊將該方法應(yīng)用于HeLa細胞核蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的分析，從1.1mg蛋白樣品中共鑒定到1414處潛在O-GlcNAc糖基化位點，其中637處（約45%）未在人源O-GlcNAc糖基化數(shù)據(jù)庫中收錄（1985-2020年），豐富了O-GlcNAc糖蛋白組基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本工作鑒定到的O-GlcNAc糖蛋白中，包括識別RNA上N6-甲基腺苷（m6A）的YTHDF1和YTHDF3蛋白，以及與之形成相互作用網(wǎng)絡(luò)的另外13種蛋白，后者與劇烈條件下應(yīng)激小體的形成密切相關(guān)，為應(yīng)激小體形成與蛋白質(zhì)O-GlcNAc之間的作用機制研究提供了新線索。
相關(guān)研究成果以“Endo-M Mediated Chemoenzymatic Approach Enables Reversible Glycopeptide Labeling for O-GlcNAcylation Analysis”為題，發(fā)表在《德國應(yīng)用化學(xué)》（Angew. Chem. Int. Ed.）上。該工作的共同第一作者是大連化物所博士研究生陳堯和中科院上海藥物所唐峰博士。上述工作得到國家自然科學(xué)基金、國家重點研發(fā)計劃、大連化物所創(chuàng)新基金、中科院青促會基金等項目的資助。
